PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：PCR的技术的主要步骤：1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。2、引物设计的基本原则1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。3、引物内部不应出现互补序列。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。扩展资料PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR、竞争PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。第一代PCR就是常见的定性PCR技术，它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR），它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。第三代PCR技术--数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。PCR芯片技术PCR仪器发展的趋势之一变得更加微型化，PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片就是在微型的载体上进行PCR反应，是微型化的PCR仪。芯片PCR不仅节省了大量反应试剂因此降低了实验成本，还有助于提高反应速度。参考资料：百度百科-PCR技术
PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：1、PCR的技术的主要步骤：①DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA②退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。③延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。2、引物设计的基本原则①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。③引物内部不应出现互补序列。④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

lz说的是下游引物吧，下游引物是针对反转录时的茎环引物设计的；lz首先要知道你的反转录引物的序列，然后设计与反转录引物的非茎环配对的下游定量引物，上游引物则是特异性结合mirna的引物
可以用PCR的反向引物，也可以用随机引物
目前发现的大多数lncRNA都带有poly(A)，可以通过Oligo(dT)、随机引物进行反转录扩增合成cDNA

构建 lncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长lncRNA 定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。然而有些 lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视 lncRNA 在基因组上的定位采取不同的研究策略。在构建 lncRNA 表达质粒时，需关注lncRNA 是否在蛋白编码基因的启动子区域或 3′-UTR 区域 ，勿遗漏重要区段。 引物设计是载体构建的第一步，也是最关键的一步，这直接决定了后续实验能否进行下去。引物设计完成后的具体操作步骤见后文。 文章正在审核中... -1.    选择合适的载体，依据实验室现有的条件进行选择：plvx-puro，Amp，puro，其他慢病毒载体的原理相似，例如pLenti-puro等2.    找到基因的CDS区，复制；对于LncRNA，则直接选择全部序列即可3.    用primer5找到 目的基因上没有 and 载体有 的酶切位点4.    确定酶切效率，在酶边是否需要加保护碱基以提高效率5.   Kozak序列（针对表达蛋白的载体，而对于L过表达载体，则不需要RNA）6.   取目的基因CDS区两端15~21个碱基（或反向互补链），加上酶切位点和kozak。当然，这个范围可以放宽。操作步骤：①  在NCBI找到基因序列，复制ORIGIN区。②  打开primer5软件，将序列复制到到中间的框内③点击Enzyme点击OK，得到该基因所包含的酶切位点数据。④ 分析载体质粒的酶切位点，这里用pLvx-puro作为目的基因的载体因此，BamH1、EcoR1不可使用，其他可用的有：Xho1、BsyB1、Apal、Smal、Xbal酶切的选择还需要考虑现实情况，我们组内有现货的酶： Xho1, Xbal。在目的基因的上下游截取15-21bp序列，点击Primers里的Add primers,根据经验选取Tm值在50-60℃左右，在上述范围内选取合适的bp。选择“引物”，“添加引物”，先设计上游引物：输入上游18bp碱基后，再插入XhoI位点：得到 CTCGAG GCTGCTGCCACGTAAGAA再设计下游引物：因下游3’端有连续22个A，若算入，则Tm值和GC含量均不达标。因此，在引物设计时，去掉尾部部分A序列，输入尾部序列，点击“反向互补序列”，插入XbaI位点，得到TTTTTGTTTGACTTTGTGTTTATTTTTAAT，Tm=50℃。查找保护碱基，随便百度都能搜到。①因此XhoI酶切位点处的上游引物为：对于LncRNA来说，不需要起始密码子，不需要Kozark序列，但是需要防止误翻译。保护碱基+酶切位点+一小段目的基因CCGCTCGAGCGG GCTGCTGCCACGTAAGAA，67%GC,Tm56℃②XbaI酶切位点对应的下游引物为：保护碱基+酶切位点+一小段目的基因若是加上A尾，GC TCTAGA GCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTGACTTTGTGTT若是不加A尾GC TCTAGA GCTTTTTGTTTGACTTTGTGTTTATTTTTAAT。对于一些过长的基因来说，直接通过两端的上下游引物，是无法扩出合适的cDNA的，因此可以选择将基因分段扩增，再进行连接。例如up主所研究的基因是6810bp，之前已经合成了1-3010长度的质粒，因此现在只要合成后半部分，再进行DNA连接即可。因为本组已有一个1-3010，两端酶切位点分别为 BamHI 和 XhoI 的pcDNA3.1载体，因此可以设计从3011开始，以XhoI作为末端的上游引物： CCGCTCGAGCGG AAAATTAGGTTTATTCAAGC。因此，可将pcDNA3.1-AFAP1-AS1以 BamHI/XhoI 做酶切得到1-3010片段，以引物扩增后的cDNA以XhoI和XbaI做酶切即可得位点为 XhoI/XbaI 的3011-6810片段，再连接在一起可得全长full-length序列，位点为 BamHI/XbaI 。再将plvx载体以BamHI和XbaI做酶切，与上述cDNA相连，即可得出plvx-AFAP1-AS1-full-length。详细的载体构建的操作步骤、注意事项等，可见于 载体合成步骤 -对于其他过长的载体，建议各位可以采取类似的方法，分段酶切、再连接。这时要注意引物的选取。接后续：阿婆主的6800bp载体做成了，直接从细胞的RNA里扩全长没成功，估计是因为实在太长了！ 后面试了，分成了3000+3800两个片段来做，可成功！！！

目前发现的大多数lncRNA都带有poly(A)，可以通过Oligo(dT)、随机引物进行反转录扩增合成cDNA

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物不能形成二级结构。③ 引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不可修饰。⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3′端引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。9.引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。 现有的引物设计软件有primer5.0比较好。